Restriktionsenzyme sind Enzyme, die sowohl einzel- als auch doppelsträngige DNA schneiden. Jedes Restriktionsenzym hat eine spezifische Nukleotidsequenz, die Restriktionsstelle genannt wird, die es erkennt und schneidet. Restriktionsenzyme werden für DNA-Sequenzierung, Mutationsanalyse und Klonierung und Amplifikation von DNA verwendet. Wissenschaftler verwenden Restriktionsenzyme, um Gene von Interesse in Expressionsvektoren, DNA-Moleküle, die getrennt von chromosomaler DNA replizieren können, einzufügen. Der Vektor, der das Gen von Interesse enthält, kann dann in einen Bakterienstamm zur Expression und Charakterisierung von Proteinen eingeführt werden.
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Schritt 1
Identifizieren Sie Restriktionsenzymstellen in Ihrem Vektor, indem Sie sich eine Restriktionskarte ansehen. Die Restriktionskarte wird Ihnen sagen, welche Enzyme Ihren Vektor schneiden und wo.
Schritt 2
Wählen Sie ein Restriktionsenzym, bei dem auf Ihrem Gen-REPLACE auch eine Stelle vorhanden ist, indem Sie die Sequenz des REPLACEs betrachten. Stellen Sie sicher, dass sich die Restriktionsstelle an einer Stelle auf Ihrer REPLACEion befindet, die sich außerhalb des interessierenden Gens befindet, damit Sie keinen Teil des Gens verlieren.
Schritt 3
Stellen Sie sicher, dass es keine Duplikate der Restriktionsstelle irgendwo in Ihrem Gen-REPLACE oder Vektor gibt. Dies wird mehrere Schnitte in Ihrer DNA verursachen und Ihnen irreführende Daten liefern.
Schritt 4
Versuchen Sie, Restriktionsenzyme zu wählen, die mit klebrigen Enden und nicht mit stumpfen Enden schneiden. Klebrige Enden treten auf, wenn das Enzym doppelsträngige DNA in einer gestaffelten Weise schneidet, wobei ein einzelsträngiger Überhang zurückbleibt, der die Bindung mit einem in der entgegengesetzten Weise geschnittenen REPLACE erleichtert. Stumpfe Enden treten auf, wenn die doppelsträngige DNA auf glatte Weise geschnitten wird, und diese sind schwieriger zu befestigen.
Schritt 5
Wählen Sie ein anderes Restriktionsenzym für beide Enden Ihres REPLACEs, um sicherzustellen, dass es in der korrekten Orientierung in den Vektor eingefügt wird und um sicherzustellen, dass der Vektor nicht wieder an sich selbst bindet.
Schritt 6
Versuchen Sie, zwei Restriktionsenzyme auszuwählen, die in demselben Puffersystem und derselben Temperatur gut funktionieren. Wenn dies nicht möglich ist, führen Sie jeden Aufschluss separat aus.
Was Sie brauchen
- Sequenz des GenREPLACEs
- Restriktionskarte für den Vektor der Wahl
- Liste der Restriktionsenzyme und ihrer Schnittstellen
Tipps
- Einige Webprogramme wurden zur Identifizierung entwickelt Restriktionsstellen auf einer DNA-Sequenz schnell. Ein solches Programm stammt von New England BioLabs.
